— Джулиано Гарлини
— Валерия Кьеричетти
— Лаура Ванони 1
— Милена Браска 1
1 CNR — ISPA, Милан
Цели. Цель настоящего исследования — оценитьinin vitroантибактериальную способность гидроксида кальция и оксида кальция с добавлением ZnO против различных микроорганизмов — обычно встречающихся в инфицированных корневых каналах.
Материалы и методы. Микроорганизмы, использованные в данном исследовании, почти все являются Грам+, за исключениемEscherichiacoli, которая является Грам-; почти все из которых являются кокковыми, за исключениемEscherichiacoli, ListeriamonocytogenesиLactobacillusparacaseisubsp.paracaseisubsp.
Экспериментальный протокол включал в себя сравнение количества микроорганизмов, выраженного в cfu/ml (колониеобразующие единицы/мл), полученных при анализе растворов, содержащих штамм как есть, и растворов, содержащих микроорганизм, введенный в контакт с тремя тестируемыми продуктами.
Результаты. Количество микроорганизмов после добавления тестируемых соединений сравнивалось с количеством микроорганизмов, полученных из штамма как есть. Сравнивая полученные данные, можно было оценить снижение микробной нагрузки при контакте с тестируемым раствором и, следовательно, степень антимикробной активности раствора в отношении рассматриваемых штаммов бактерий.
Выводы. Из результатов, полученных в данном исследованииinvitroоксид кальция представляется материалом с наилучшими антимикробными свойствами и, следовательно, возможным кандидатом на идеальную промежуточную повязку. Эти обнадеживающие результатыinvitroтакже требуют поддержки дальнейших исследованийinvitroиinvivoдля дальнейшего подтверждения.
Ключевые слова: эндодонтическая терапия, промежуточная повязка, антимикробная активность, оксид кальция, гидроксид кальция.
Резюме
Оценка антибактериальной способности трех веществ для промежуточных препаратов в эндодонтии: сравнительный тестin vitro
Цели. Целью данного исследования является оценкаin vitroантибактериальных свойств гидроксида кальция и оксида кальция с ZnO для использования в лечении различных микроорганизмов, обычно встречающихся в инфицированных корневых каналах.
Материалы и методы. Микроорганизмы, использованные в данном исследовании, почти все являются Грам+, за исключениемEscherichia coli, которая является Грам-; почти все шаровидные (кокки), за исключениемEscherichia coli, Listeria monocytogenesиLactobacillus paracaseisubsp.paracasei , которые имеют палочковидную форму. Принятый экспериментальный протокол предусматривал сравнение между количеством микроорганизмов, выраженным как cfu/ml (колониеобразующие единицы/мл), полученным при анализе растворов, содержащих сырой образец и растворов, содержащих микроорганизмы, помещенные в контакт с тремя тестируемыми соединениями.
Результаты. Количество микроорганизмов после добавления тестируемых соединений сравнивалось с количеством микроорганизмов, полученным из сырого образца. Сравнение позволило оценить снижение бактериальной нагрузки в результате контакта с тестируемыми соединениями и измерить их антимикробные свойства по отношению к рассматриваемым штаммам бактерий.
Выводы. Результаты, полученные в ходе данного исследованияin vitro, показали, что оксид кальция обладает наилучшими антимикробными свойствами и является возможным кандидатом для интраканального применения. Обнадеживающие результатыin vitroдолжны быть продолжены дальнейшими исследованиямиin vitroиin vivoдля подтверждения полученных результатов.
Ключевые слова: эндодонтическая терапия, интраканальная повязка, антибактериальные свойства, оксид кальция, гидроксид кальция.
Nell’ambito dei rapporti che l’uomo contrae con i microrganismi, il cavo orale rappresenta un importante punto di contatto con l’ambiente esterno. La bocca è facilmente accessibile ai germi dell’aria, dell’acqua, del cibo e a quelli delle comunità microbiche di altre superfici corporee, soprattutto delle mani. Бактериальная популяция полости рта включает многочисленные виды и, в частности, стрептококки, лактобактерии, коринебактерии, актиномицеты, стафилококки, а также большое количество облигатных анаэробов (Veillonellassp., Bacteroidesspp., анаэробные спирохеты и т.д.). Микроорганизмы являются основным фактором развития перирадикулярных поражений и конечной неудачи эндодонтического лечения 1 . Различные процедуры, используемые для уменьшения бактериального загрязнения эндодонтии, включают механическое воздействие инструментов для корневых каналов, ирриганты, промежуточные повязки и, в определенной степени, цементы для корневых каналов.
Несколько исследований показали, что совместное использование инструментов и ирригаторов с антибактериальным эффектом может уменьшить присутствие бактерий только в 50-75% инфицированных каналов2 . Для решения проблемы возможного остаточного загрязнения канала было предложено использовать промежуточные повязки, такие как гидроксид кальция 3 . Однако некоторые виды факультативных анаэробных бактерий оказались устойчивыми к этому препарату 4 . Оксид кальция может быть альтернативным материалом для внутриканальных повязок, представленных до сих пор. В нашей предыдущей работе 5 мы проверили in vivo антибактериальные возможности двух различных промежуточных перевязочных материалов (оксид кальция и гидроксид кальция) по сравнению с контролем, не исследуя природу бактериальных штаммов. Цель настоящего исследования — оценитьinin vitroантибактериальную способность против различных микроорганизмов — обычно встречающихся в инфицированных корневых каналах — трех различных соединений: гидроксида кальция (Calxyl, OCO Praeparate GmbH, Dirmstein, Германия) и оксида кальция с добавлением ZnO в двух различных составах (Endocalex Plus и Endocalex 6-9, Robidan s.a.s., Milano).
Материалы и методы
В настоящем исследовании было решено проверить антимикробную активность гидроксида кальция и оксида кальция против основных микроорганизмов, колонизирующих корневые каналы человека6, 7 . Микроорганизмы, использованные в данном исследовании, почти все являются Грам+, за исключениемEscherichiacoli, которая является Грам-; почти все из которых имеют кокковую форму, за исключениемEscherichiacoli, ListeriamonocytogenesиLactobacillusparacaseisubsp. paracasei, которые являются палочками. Различные штаммы были выбраны дляEnterococcusfaecalisиStaphylococcusaureus, поскольку эти два вида содержат микроорганизмы, которые наиболее трудно искоренить из инфицированных корневых каналов. Их сохранение может быть связано с низкой эффективностью ирригаторов, таких как гипохлорит натрия, или промежуточных повязок, таких как гидроксид кальция, против них8, 9 . В таблице 1 перечислены использованные штаммы с их идентификационными кодами.
2. Эффект вихревой мешалки.
Штаммы бактерий, протестированные в ходе исследования, хранились в лаборатории CNR-ISPA Милана в лиофилизированном виде при температуре 4 °C. Перед использованием, чтобы иметь в наличии свежую культуру, штаммы выращивали в специальной культуральной среде (Brain Heart Infusion broth — BHI — Scharlau, Испания) в течение 24 часов при 37 °C в аэробных условиях, за исключением микроорганизмаStreptococcussalivariussubsp. salivarius, который был выращен в микроаэрофильных условиях, оптимальной ситуации развития для этого микроорганизма. После инкубации (штамм как есть) культуры микроорганизмов подсчитывали, и их концентрация в зависимости от микроорганизма составляла от 10 5 до 10 9 КОЕ/мл. Протокол эксперимента требовал, чтобы каждый тестируемый микроорганизм инокулировался параллельно при следующих условиях:
- раствор 1 (T0): 5 мл бульона BHI, инокулированного 0, 1 мл микроорганизма как есть (положительный контроль), инкубируется при 37 °C в течение 24 часов;
- раствор 2: 5 мл бульона BHI, инокулированного 0, 1 мл микроорганизма как есть с добавлением испытуемого продукта, инкубация при 37 °C в течение 24 часов;
- раствор 3: 5 мл бульона BHI плюс 0, 1 мл микроорганизма как есть с добавлением тестового продукта, инкубация при 37 °C в течение 48 ч.
Для имитации формы зараженного корневого канала контрольный и тестовый растворы помещались в стерильные пробирки (рис. 1), также для облегчения контакта между микроорганизмом и тестируемым антимикробным веществом. Продукты Endocalex Plus и Endocalex 6-9 были приготовлены в соответствии с инструкциями производителя, т.е. путем смешивания порошка с соответствующей жидкостью, состоящей из пропиленгликоля (75%) и дистиллированной воды (25%). Для приготовления пасты использовалась стеклянная пластина и шпатель, абсолютно свободный от других веществ; два соединения гомогенизировались путем кратковременного нанесения шпателя до получения достаточно жидкой пасты. Аликвоту пасты добавляли в соответствующую пробирку с помощью стерильного ватного тампона так, чтобы тестируемый раствор непосредственно контактировал с микроорганизмом.
3. Примеры роста колоний микроорганизмов на среде BHI.
Гидроксид кальция помещали непосредственно в контакт с микроорганизмом и его культуральным бульоном с помощью ватного тампона. Затем каждую пробирку встряхивали с помощью вихревой мешалки, чтобы улучшить контакт между микроорганизмами и испытуемым раствором (рис. 2). Затем все пробирки инкубировали при 37 °C в течение 24 часов или 48 часов в соответствии с требованиями операционного протокола. После инкубации были сделаны соответствующие серийные разведения для оценки концентрации присутствующих микроорганизмов. 1 мл соответствующих серийных разведений инокулировали в чашки Петри и в каждую добавляли 10-15 мл агара BHI (Scharlau, Испания). Когда агар затвердел, пластины инкубировали при 37 °C в течение 48 часов. После инкубации проводили подсчет колоний и результат выражали в виде cfu/ml (колониеобразующие единицы/мл) (Рисунок 3 ).
Первым важным результатом, который мы получили, было то, что тестируемые растворы сразу же расширялись в культуральном бульоне: это свидетельствует о том, что контакт между микроорганизмом и тестируемым антимикробным веществом произошел правильно. На самом деле, было решено не использовать минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) в качестве теста для сравнения антибактериальной активности двух ирригантов, как это предлагается руководством Национального комитета по стандартам клинической лаборатории 10 , потому что метод, которому мы следовали, мог помочь преодолеть недостатки, обычно связанные с оценкой антимикробного эффекта раствора путем измерения зоны ингибирования: в этом случае трудно оценить вариации в степени диффузии соединений через агар, так же как трудно наблюдать зоны ингибирования роста бактерий 9 . Количество микроорганизмов, полученное после добавления тестируемых соединений, сравнивалось с количеством, полученным после анализа количества, относящегося к штамму «как есть» (раствор 2). Сравнивая данные, представленные на графиках на рисунках 4 и 5, можно оценить, произошло ли снижение микробной нагрузки при контакте с тестируемым раствором и, следовательно, можно ли утверждать, что раствор обладает антимикробной активностью против рассматриваемых штаммов бактерий.
Что касается антибактериальной способности через 24 часа после добавления продукта, были получены следующие результаты: гидроксид кальция был наиболее эффективен против 3 бактериальных штаммов (StaphylococcusaureusSA30, StaphylococcusaureusSA249 иListeriamonocytogenesATCC 9525 CV22), Endocalex 6-9 для 5 штаммов (StaphylococcusaureusAS, EnterococcusfaecalisMora 13, StreptococcusthermophilusBT63, LactococcuslactisL7 иStaphylococcusepidermidis) и Endocalex Plus для 2 штаммов (Enterococcusfaecalis192 иLactobacillusparacaseisubsp. paracasei). Эффективность была эквивалентна для гидроксида кальция и Endocalex Plus 1 раз (образецStreptococcussalivariussubsp.salivariusSSS), тогда как Endocalex 6-9 и Endocalex Plus были эквивалентны в 5 случаях. В случае микроорганизмаEscherichiacoliATCC 8739 CV25 все три раствора показали аналогичное поведение. После 48 часов инкубации (раствор 3) было получено дальнейшее снижение количества бактерий, причем заметно большее снижение в случае Endocalex Plus и Endocalex 6-9. Продукты Endocalex 6-9 и Endocalex Plus показали дальнейшее снижение концентрации микроорганизмов почти во всех случаях: для 12 образцов даже наблюдались результаты 10 -10 11 микроорганизмов. Бактерии сначала прилипают к зубу обратимо, а затем необратимо. Как только бактериальные клетки прочно закрепляются на поверхности зуба, они начинают размножаться. Вторжение бактерий в эндодонтическое пространство приводит к некрозу пульпы с последующим инфицированием перирадикулярных тканей. Цель эндодонтической терапии — уничтожить инфекцию и дать возможность пораженным тканям зажить 11 . На этапе механического формирования некротические ткани пульпы в эндодонте и на стенках канала удаляются с инструментов. Очищение эндодонтической системы доверяется действию ирригационных растворов, которые обладают способностью растворять и удалять органические ткани. Идеальный ирригационный раствор, согласно современной концепции эндодонтии, которая предусматривает полное опорожнение эндодонтического пространства и его полную трехмерную обтурацию, должен оказывать антибактериальное действие, растворять ткани и органический материал, присутствующий в каналах, оказывать смазывающее действие, способствующее работе инструментов корневого канала, предотвращать образование слоя мазка или способствовать его удалению без декальцинации тканей зуба и, наконец, не быть токсичным для организма.
4. Количество бактерий после 24 и 48 часов инкубации.
Одним из наиболее часто используемых ирригантов в эндодонтической терапии является гипохлорит натрия, который, как утверждается, способен резко снизить интраканальную бактериальную нагрузку. В литературе сообщалось о снижении бактериальной нагрузки до 53% и количества бактерий с 10 3 до 10 212, 13 . Не все бактерии удаляются, и по этой причине некоторые авторы предлагают сочетать промывание корневых каналов с промежуточными повязками с антимикробной активностью 14-17 . Целью промежуточной повязки будет радикальное снижение риска выживания бактерий до процедуры ирригации/дезинфекции системы корневого канала, даже если она будет выполненаlegeartis. Более того, в некоторых публикациях показано, что использование промежуточной повязки может быть важным для дезинфекции любых корневых перешейков или ветвей 18, 19 . Применение промежуточной повязки, по крайней мере, на одну неделю, может способствовать уменьшению количества бактерий в корневом канале. Предыдущие исследования показали, что некоторые вещества, такие как гидроксид кальция, хлоргексидин, их комбинация и гипохлорит натрия 13, 14, 17, 20, по-видимому, не способны обеспечить значительные результаты в этом отношении. Наиболее часто используемым веществом в настоящее время является гидроксид кальция, антибактериальное действие которого, как говорят, связано с высвобождением гидроксильных ионов, которые вызывают постепенное повышение рН внутри канала, несовместимое с выживанием большинства видов бактерий, присутствующих в некротической пульпе зуба. Многочисленные исследования, проведенные на удаленных зубах 21-23, показали, что ионы OH¯, высвобождаемые гидроксидом кальция, медленно, но постепенно диффундируют в дентинные канальцы и в любые углубления эндодонтической системы, которые не были достигнуты при химико-механическом препарировании каналов.
Известно также, что диффузия ионов OH¯ больше, если порошок гидроксида кальция смешать с дистиллированной водой, чем, например, с физраствором или пропиленгликолем. Некоторые авторы, однако, не показали большой клинической эффективности гидроксида кальция в снижении бактериальной нагрузки 23 . Альтернативой может быть оксид кальция. Это вещество используется с начала 1960-х годов, когда Бернард начал публиковать результаты использования расширителей из оксида кальция в стоматологии24, 25 . Автор описал хорошо известную «оксикокковую» терапию лечения корневых каналов, которая основана на трех основных функциях оксида кальция: расширение, дезинфекция и обтурация. Его противомикробные свойства объясняются расширительными свойствами оксида кальция и дезинфицирующими свойствами образуемого им иона OH¯. Расширение оксида кальция происходит путем «замещения», что позволяет ему проникать даже в самый недоступный эндодонт26, 27 . Объемное расширение оксида кальция совпадает с объемом воды, присутствующей в эндодонтических углублениях, которая химически соединяется с образованием гидроксида кальция. Антимикробная способность обусловлена активностью гидроксила, щелочная функция которого имеет свойство осуществлять полное разрушение органических остатков и их последующее превращение в растворимые, нетоксичные и рассасывающиеся продукты (H2O и CO2) 27, 28 .
5. Количество бактерий после 24 и 48 часов инкубации: результаты
Из результатов, полученных в этом сравнительном анализеinin vitroоксид кальция представляется жизнеспособной альтернативой гидроксиду кальция. В результате, после 24 часов инкубации антибактериальное действие Endocalex Plus и Endocalex 6-9 немного превосходило действие гидроксида кальция в отношении некоторых штаммовStaphylococcusaureusиEnterococcusfaecalis. В 48-часовых подсчетах, однако, можно наблюдать увеличение антибактериального свойства оксида кальция с уменьшением бактериальной нагрузки до значений 5 , подтвержденных этим экспериментомinin vitro, представляются интересными. Продукты Endocalex 6-9 и Endocalex Plus, по сравнению с гидроксидом кальция, показали улучшенную антибактериальную способность через 24 часа, которая еще больше увеличилась через 48 часов. В частности, значительная ингибирующая способность наблюдалась в отношенииEnterococcus faecalis, микроорганизма, который всегда был основной причиной эндодонтических неудач. Из результатов, полученных в данном исследованииinvitroоксид кальция представляется материалом с наилучшими антимикробными свойствами и, следовательно, возможным кандидатом на идеальную промежуточную повязку. Такие обнадеживающие результатыinvitroтакже требуют поддержки других исследованийinvitroиinvivoдля дальнейшего подтверждения.
