— Лука Скаполи 1
— Амбра Жирарди 1
— Дорина Лауритано 2
— Аннализа Пальмиери 1
1 Кафедра специализированной, диагностической и экспериментальной медицины, Болонский университет, Италия
2 Факультет междисциплинарной медицины и хирургии, Университет Милано-Бикокка, Милан, Италия
Заболевание пародонта разрушает ткани, поддерживающие элементы зуба. Повреждение тканей происходит в результате длительной воспалительной реакции на микробиологические изменения в составе субгингивальных биопленок.
Три вида бактерий, составляющих комплекс красной группы — Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsizia и Treponema denticola — считаются основными возбудителями пародонтита.
В настоящем исследовании был разработан анализ ПЦР в реальном времени для обнаружения и количественного определения видов «красного комплекса» для исследования 307 образцов пародонтальных карманов 127 пациентов с пародонтитом и 180 контрольных. Результаты показали значительное преобладание видов красного комплекса и повышенное количество P. gingivalis и T. denticola в пародонтальных карманах пациентов с пародонтитом.
Резюме
Инновационные технологии в клинической практике: современный диагностико-терапевтический подход к заболеваниям пародонта.
Пародонтит — это заболевание, вызванное в основном хронической инфекцией тканей, поддерживающих зубы. Несколько факторов, таких как диабет, курение и уход за полостью рта, а также генетическая предрасположенность могут влиять как на риск развития пародонтита, так и на его прогрессирование. Целью исследования было проверить, связаны ли аллели генов-кандидатов с пародонтитом. Было проведено исследование методом случай-контроль с участием 182 пациентов с хроническим пародонтитом и 230 здоровых людей из итальянской популяции. Всего было исследовано шесть однонуклеотидных полиморфизмов из пяти генов-кандидатов, а именно IL1A, IL1B, IL6, IL10 и VDR. Доказательства ассоциации были получены для rs1800795, картированного в IL6 (P = 0, 01), а также для rs1800872, картированного в IL10 (P = 0, 04). Более редкий вариант аллеля снижал риск развития пародонтита при IL6 OR = 0, 69 (95% C.I. 0, 51-0, 93), в то время как повышал риск при IL10 OR = 1, 38 (1, 01-1, 86). Настоящее исследование показало, что полиморфизмы IL6 и IL10 являются факторами риска хронического периодонтита, в то время как не было доказательств, указывающих на специфический генотип IL-1A или IL-1B.
Пародонтоз является многофакторным заболеванием, в котором как экологические, так и генетические факторы играют точную и противоречивую роль в определении его возникновения. Бактериальная флора полости рта, безусловно, играет важную роль в развитии этого заболевания. Другими широко изученными факторами риска являются курение и диабет. Однако ряд генетических факторов хозяина может влиять на индивидуальную восприимчивость к заболеванию, определять его различные клинические проявления и скорость прогрессирования 1 .
В отличие от менделевских генетических заболеваний, которые встречаются редко и вызываются одной или несколькими мутациями, многофакторные заболевания, такие как пародонтит, встречаются часто и связаны с многочисленными экологическими и генетическими факторами. Генетические факторы — это не истинные мутации, а генетические полиморфизмы, также называемые факторами восприимчивости. Каждый из них не является ни необходимым, ни достаточным для определения заболевания, но они могут изменять риск его возникновения.
Эти полиморфизмы представляют собой вариации генетического кода, которые могут иметь различные эффекты, например, изменять уровень экспрессии генов, вызывать незначительные функциональные изменения в кодируемых молекулах, делать индивидуумов более восприимчивыми к возникновению того или иного заболевания или появлению более тяжелых клинических картин самого заболевания 2 .
В последние годы исследования факторов предрасположенности к развитию заболеваний пародонта в основном были направлены на изучение генов, кодирующих факторы, участвующие в модуляции иммунного ответа, рецепторы клеточной поверхности, хемокины, ферменты и белки, связанные с распознаванием антигенов. Цитокины, такие как IL-1A, IL-1B, IL-10 и IL-6, являются ключевыми факторами, опосредующими воспалительный процесс при заболеваниях пародонта. Они играют роль в активации, пролиферации и дифференцировке В-клеток, основных клеток, вовлеченных в тяжелые проявления пародонтита 3 .
Таким образом, эти генетические вариации могут способствовать прогрессированию заболевания 4 , вызывая классическую картину повторяющихся циклов воспаления тканей с последующими спонтанными ремиссиями (так называемый «pousses» паттерн) 5 .
При заболеваниях пародонта патогенные бактерии, скапливающиеся в поддесневой борозде, являются факторами окружающей среды, которые влияют на воспалительную реакцию тканей пародонта 6 . Однако считается, что цитокины также косвенно ответственны за разрушение соединительной ткани и резорбцию костей 7 .
Поскольку резорбция альвеолярной кости является ключевым фактором развития заболеваний пародонта, рецептор витамина D (VDR) рассматривается как фактор предрасположенности к развитию заболевания. Данные литературы подтверждают существование ассоциации между распространенными полиморфизмами генов-кандидатов и заболеваниями пародонта8, 9 .
Интересно отметить, что в большинстве генетических исследований пародонтита использовались небольшие когорты. Ограниченная статистическая мощность исследований, проведенных с небольшим количеством образцов, приводит к неточной оценке уровня генетического риска и опасности получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
Это также объясняет тот факт, что подобные исследования часто приходят к противоположным выводам. Поэтому тщательный отбор большого количества образцов является необходимым условием для правильного выявления любой ассоциации между генетическими полиморфизмами и возникновением пародонтита. Кроме того, количество и тип генов, влияющих на течение заболеваний пародонта, может варьироваться в зависимости от этнической принадлежности исследуемой популяции и степени тяжести заболевания.
В настоящей работе мы проанализировали шесть специфических полиморфизмов в генах, кодирующих IL-1A, IL-1B, IL-6, IL10 и VDR, чтобы проверить, действуют ли они как факторы предрасположенности к хроническим заболеваниям пародонта в итальянской популяции.
Материалы и методы
Для этого исследования было набрано 412 человек; из них 182 человека страдали хроническими заболеваниями пародонта, а контрольная группа состояла из 230 здоровых взрослых или людей с легким гингивитом.
В таблице 1 приведены основные характеристики и клинические данные, собранные в группах.
Биологический отбор проб проводился из пародонтального кармана одного участка путем введения бумажного конуса с помощью прибора LABtest (любезно предоставленного компанией LAB® srl, Кодигоро, Феррара).
ДНК выделяли и очищали по стандартному протоколу, включающему инкубацию с протеиназой К, с последующей очисткой на спин-колонке.
Генотипирование
Были исследованы следующие шесть полиморфизмов: для IL1A — NM_000575.3:c.-949C>T (rs1800587); для IL1B — NM_000576.2:c.315C>T (rs1143634); для IL6 — XR_108749.1:n.50-321G>C (rs1800795);
для IL10 — NG_012088.1:g.3943A>G (rs1800896) и NG_012088.1:g.4433A>C (rs1800872); для VDR — NM_000376.2:c.1056T>C (rs731236).
Отбор анализов осуществлялся с помощью программного обеспечения Applied Biosystems SNPbrowser Software (Life Technologies, Милан).
Генотипы для всех полиморфизмов были получены с помощью ABI PRISM 7500 Sequence Detection System
и методом TaqMan, согласно протоколам, предоставленным компанией (Life Technologies, Милан).
Сбор генотипов проводился исследователями в слепой системе (биологи не располагали клинической информацией о пациентах, от которых поступали анализируемые образцы) .
Статистический анализ
Распределение генотипов у пациентов и контрольной группы было проверено на отклонения от равновесия Харди-Вайнберга с помощью теста χ 2. Генетическая ассоциация оценивалась с помощью генотипических и аллельных тестов с использованием метода отношения правдоподобия с помощью программного обеспечения Unphased v3.1.5 на операционной системе Windows Vista 10.
Для оценки влияния редкого аллеля у носителей как для гетерозигот, так и для гомозигот были рассчитаны коэффициенты умножения. Ассоциация гаплотипов была оценена для кластера IL1 (IL1A и IL1B) и IL10, поскольку были доступны два близких полиморфизма. В частности, был проведен глобальный тест ассоциации, а также тест ассоциации, специфичный для гаплотипов.
Протокол генетического анализа геномной ДНК пациента, полученной и очищенной из кревикулярной жидкости, оказался очень эффективным. Фактически, процент успешного генотипирования 6 различных полиморфизмов составил от 96% до 99%.
Только 20 из 412 образцов ДНК дали три или менее генотипов из шести.
Было установлено, что частоты генотипов находятся в согласии с равновесием Харди-Вайнберга как во всей выборке, так и в каждой группе (случаи и контроль).
Сравнение частот аллелей, наблюдаемых в случаях и контроле, показано в таблице 2.
Значительная разница наблюдалась между случаями и контролем для полиморфизмов rs1800795 IL6 (P = 0, 01) и rs1800872 IL10 (P = 0, 04). Вместо этого были получены маргинальные значения ассоциации для SNP rs731236 из VDR (P = 0, 09).
Действительно, было установлено, что лица, несущие редкий аллель для вариантов IL6 и VDR, менее подвержены пародонтиту, со значениями OR = 0, 69 (95% CI 0, 51-0, 93) и OR = 0, 79 (95% CI 0, 59-1, 05), соответственно. В отличие от этого, редкий аллель для IL10 показал повышенный риск OR = 1, 38 (CI 95% 1, 01-1, 86).
Тест на генотипическую ассоциацию дал эквивалентные результаты (Таблица 3).
Полиморфизм rs1800795 IL6 показал значительную общую генотипическую ассоциацию (P value = 0, 02) и более низкий риск для носителей редкого аллеля как в гетерозиготности, так и в гомозиготности, с OR = 0, 58 (CI 95% 0, 37-0, 89) и OR = 0, 54 (CI 95% 0, 28-1, 04), соответственно.
Значения, эти, близки к номинальным уровням значимости.
Высокие уровни неравновесия связей были показаны между SNPs кластера гена IL1 (D’.= 0, 75; r2 = 0, 44) и между SNPs гена IL10 (D’ = 0, 93; r2 = 0, 22).
Это позволило нам объединить данные двух соседних маркеров для проведения анализа ассоциации гаплотипов.
Общий статистический анализ, чтобы проверить, связаны ли гаплотипы в целом с пародонтитом, показал отсутствие ассоциации как с кластером гена IL1 (P = 0, 87), так и с локусом IL10 (P = 0, 16).
Конкретные значения ассоциации и расчетные коэффициенты шансов для каждого гаплотипа представлены в таблице 4.
Гаплотип rs1800896(A)-rs1800872(A) показал пограничный уровень ассоциации с пародонтитом OR = 1, 29 (CI 95% 0, 91-1, 84), p-value = 0, 06.
Обсуждение
Во многих исследованиях оценивалась ассоциация между генетическими вариантами и заболеваниями пародонта, однако среди ученых до сих пор нет согласия относительно корреляции между генетической основой и клиническими проявлениями этого заболевания.
На самом деле, многочисленные исследования часто сообщали о противоречивых результатах, в основном из-за различной этнической принадлежности изучаемых групп населения, а также из-за небольшого размера выборки. Действительно, такие исследования — с менее чем 100 пациентами и 100 контрольными группами — не могут обеспечить статистическую мощность для обнаружения умеренного генетического эффекта, т.е. отношения шансов 1, 5 или менее.
Другой источник изменчивости может быть связан с различными целями исследований, которые иногда были направлены на изучение ассоциации между генетическими полиморфизмами и конкретными фенотипами, такими как агрессивный пародонтит или хронический пародонтит, или ассоциации с различным ответом на клиническое лечение. Здесь мы сообщаем о результатах генетического исследования, проведенного с участием 182 пациентов с хроническим пародонтитом и 230 контрольных лиц, все итальянского происхождения. В качестве источника геномной ДНК использовалась кревикулярная жидкость, собранная с помощью бумажного зонда.
Эффективность генетического теста на этой ДНК была высокой, фактически он обеспечил около 98% генотипов. Результаты анализа генетической ассоциации различных локусов обсуждаются ниже для каждого локуса.
IL1A и IL1B
Гены IL1A и IL1B и семь других генов семейства интерлейкина 1 образуют кластер генов цитокинов на хромосоме 2. Полиморфизмы в IL1A и IL1B были одними из самых первых и наиболее широко исследованных на предмет их связи с пародонтитом. В настоящей работе не было обнаружено доказательств ассоциации между rs1800587 (также известным как IL1A-889C>T), rs1143634 (также известным как IL1B 3954 C>T) и заболеванием. Заслуживают внимания найденные значения отношения шансов, поскольку они были близки к 1 как при анализе аллельной, так и генотипической ассоциации; результаты свидетельствуют об отсутствии тенденции к ассоциации. Аналогичные результаты были получены при совместном анализе обоих полиморфизмов при анализе гаплотипов (Таблица 4).
В недавнем обзоре, рассматривающем исследования с участием не менее 100 человек как в случаях заболевания, так и в контроле, авторы пришли к выводу, что полиморфизмы кластера гена IL1 не могут рассматриваться как факторы риска или предрасположенности к агрессивному или хроническому периодонтиту 9 . Наши результаты, полученные на выборке итальянского населения, приводят к такому же выводу. С другой стороны, мета-анализ, объединивший данные 13 исследований, проведенных на кавказских пациентах, страдающих хроническими заболеваниями пародонта, выявил значительные корреляции для двух отдельных вариантов генов (IL1A OR = 1, 48 и IL1B OR = 1, 54). Учитывая, что размер выборки нашего исследования позволяет выявить такой уровень ассоциации (расчет не приводится), можно предположить, что этот контраст обусловлен генетической гетерогенностью между различными европеоидными популяциями, поскольку не было обнаружено, что полиморфизмы IL1 связаны с заболеваниями пародонта в итальянской популяции. Другие исследования, проведенные на выборках из итальянского населения, не выявили никакой связи с агрессивным пародонтитом 11 .
Полиморфизмы отображения IL6 неоднократно сообщалось как о факторах риска как хронического, так и агрессивного пародонтита в различных популяциях; другие исследования показывают отрицательную ассоциацию 9 . Следовательно, авторы обзора утверждают, что никаких твердых выводов относительно этого локуса сделать нельзя.
В нашем исследовании самый сильный уровень ассоциации был обнаружен в этом локусе, где аллельный вариант rs1800795-C (полиморфизм, также известный как IL6-174G>C) был значительно меньше представлен у пациентов с заболеваниями пародонта. Это указывает на то, что у носителей аллеля rs1800795-C риск развития заболеваний пародонта был примерно в два раза ниже, как это ранее наблюдалось другими исследователями 9 .
Было высказано предположение, что IL10 может замедлять разрушение тканей пародонта через индукцию тканевых ингибиторов металлопротеиназ и остеопротегерина, известного ингибитора остеокластогенеза 12 .
В нашем исследовании были изучены два полиморфизма восходящего участка гена IL10, который регулирует уровень его экспрессии. Было отмечено, что аллельный вариант rs1800872-A повышает риск развития пародонтита с наблюдаемым ОР 1, 38 (ДИ 95% 1, 01-1, 86).
Интересно, что Reichert и др. продемонстрировали, что этот аллель является функциональным в развитии хронических заболеваний, будучи связанным со снижением экспрессии IL10 13 .
Рецептор витамина D (VDR) регулирует множество биологических процессов, включая метаболизм костной ткани и иммунный ответ на микробные инфекции 14 . Поскольку резорбция альвеолярной кости и скопление бактерий являются основными признаками заболеваний пародонта, возможно, что рецептор витамина D (VDR) и его генетические полиморфизмы играют определенную роль в предрасположенности к возникновению заболеваний пародонта.
В настоящем исследовании наблюдался уровень связи между VDR и пародонтитом, граничащий со статистической значимостью.
Дополнительное исследование с использованием независимых дополнительных образцов или различных полиморфизмов может дать дополнительную информацию для уточнения роли VDR при пародонтите.
Выводы
В данном исследовании была продемонстрирована статистически значимая ассоциация между распространенными аллельными вариантами IL6 rs1800795-G и IL10 rs1800872-A и заболеваниями пародонта.
Эти данные поддерживают использование этих полиморфизмов в анализе на основе ДНК для улучшения диагностики заболеваний пародонта.
Дальнейшее развитие нашего исследования может позволить применить его в клинической практике стоматолога.
Знание генетического профиля пациента, или, другими словами, его предрасположенности к заболеванию, может иметь большое значение для диагностики заболеваний пародонта и определения индивидуального плана лечения. Кроме того, он может дать прогностические указания на исход заболевания.
Соответствие
Аннализа Пальмиери
Департамент специализированной, диагностической и экспериментальной медицины
Болонский университет
Via Belmeloro, 8 — Болонья
Благодарности
Эта работа была поддержана компанией LAB srl, Кодигоро (Fe), Италия.
Библиография
1. Heitz-Mayfield LJ. Прогрессирование заболевания: определение групп высокого риска и отдельных лиц по развитию пародонтита. J Clin Periodontol 2005;32 Suppl 6:196-209.
2. Craandijk J, van Krugten MV, Verweij CL, van der Velden U, Loos BG. Полиморфизмы гена фактора некроза опухоли-альфа в связи с пародонтитом. J Clin Periodontol 2002;29:28-34.
3. Yamazaki K, Nakajima T, Gemmell E, Polak B, Seymour GJ, Hara K. IL-4- и IL-6-продуцирующие клетки в тканях пародонта человека. J Oral Pathol Med 1994;23:347-53.
4. Scarel-Caminaga RM, Trevilatto PC, Souza AP, Brito RB, Jr., Line SR. Исследование полиморфизма гена IL4 у лиц с разной степенью хронического пародонтита в бразильской популяции. J Clin Periodontol 2003;30:341-5.
5. Duff GW. Молекулярная генетика цитокинов: Цитокины при хронических воспалительных заболеваниях. In: Thompson, editor. The cytokine handbook. London: Academic Press., 1998:21-33.
6. Wilson M, Reddi K, Henderson B. Цитокин-индуцирующие компоненты пародонтопатогенных бактерий. J Periodontal Res 1996;31:393-407.
7. Okada H, Murakami S. Cytokine expression in periodontal health and disease. Crit Rev Oral Biol Med 1998;9:248-66.
8. Karimbux NY, Saraiya VM, Elangovan S, Allareddy V, Kinnunen T, Kornman KS, et al. Interleukin-1 gene polymorphisms and chronic periodontitis in adult caucasians: a systematic review and meta-analysis. J Periodontol 2012 Nov;83(11):1407-19.
9. Laine ML, Loos BG, Crielaard W. Gene polymorphisms in chronic periodontitis. Int J Dent 2010:324719.
10. Dudbridge F, Gusnanto A. Оценка порогов значимости для сканирования геномных ассоциаций. Genet Epidemiol 2008;32:227-34.
11. Scapoli C, Borzani I, Guarnelli ME, Mamolini E, Annunziata M, Guida L, et al. IL-1 gene cluster is not linked to aggressive periodontitis. J Dent Res 2010;89(5):457-61.
12. Claudino M, Trombone AP, Cardoso CR, Ferreira SB Jr, Martins W Jr, Assis GF, et al. The broad effects of the functional IL-10 promoter-592 polymorphism: modulation of IL-10, TIMP-3, and OPG expression and their association with periodontal disease outcome. J Leukoc Biol 2008;84:1565-73.
13. Reichert S, Machulla HK, Klapproth J, Zimmermann U, Reichert Y, Glaser CH, et al. Interleukin-10 promoter haplotype ATA is a putative risk factor for aggressive periodontitis. J Periodontal Res 2008;43:40-7.
14. Amano Y, Cho Y, Matsunawa M, Komiyama K, Makishima M. Увеличение ядерной экспрессии и трансактивации рецептора витамина D кардиотоническим стероидом буфалином в клетках миелоидной лейкемии человека. J Steroid Biochem Mol Biol 2009;114:144-51.
